راه‌اندازی آزمایشگاه سیتوژنتیک

مطالعه‌ی کروموزوم‌ها و تقسم سلولی، سیتوژنتیک نامیده می‌شود. هر بافت با سلول‌های زنده و هسته‌دار قادر به تقسیم می‌تواند برای مطالعه‌ی کروموزوم‌های انسان به کار رود. اگرچه نمونه‌ی مناسب آنالیز کروموزومی را می‌توان به سهولت از پوست، مغزاستخوان، پرزهای کوریونی یا سلول‌های مایع آمنیوتیک (آمنیوسیت‌ها) نیز به دست آورد، ولی معمول‌ترین آن‌ها لنفوسیت‌های خون محیطی است. انتخاب بافت بسته به بیمار متفاوت است، به‌عنوان مثال برای تشخیص پیش از تولد در جنین، از مایع آمنیوتیک(Amniotic Fluid) و پرزهای جفتی(Chorionic Villus) استفاده می‌‌گردد. برای بالغین و نوزادان از خون محیطی (Peripheral Blood)، و به میزان کمتری از مغز استخوان، پوست وبافت‌های دیگر نیز استفاده می‌شود. در مواردی که ناهنجاری‌های کروموزومی، اکتسابی و با Neoplasms در ارتباط باشد، از بافتی که در بدخیمی در‌گیر است برای بررسی می‌توان استفاده کرد. تمام بافت‌هایی که برای تهیه کروموزوم به کار می‌روند در محیط کشت در آزمایشگاه، کشت داده می‌شوند. آزمایش کاریوتایپ برای توضیح فتومیکروگراف کروموزوم‌های یک فرد که به روش استاندارد مرتب شده انجام می‌شود. این آزمایش به بررسی تغییرات کروموزومی پرداخته و در واقع تصویری از تعداد و ساختار کروموزوم‌های فرد ارائه می‌دهد که به وسیله‌ی آن بسیاری از اختلالات و ناهنجاری‌های کروموزومی تشخیص داده می‌شود. مراحل انجام آزمایش شامل کشت، هاروست، لام‌گیری یا تهیه‌ی گستره‌ی کروموزومی، رنگ آمیزی کروموزوم‌ها و بررسی دقیق زیر میکروسکوپ می‌باشد.

تجهیزات و فضاهای لازم در آزمایشگاه سیتوژنتیک:

• هود Laminar:

هر آزمایشگاه سیتوژنتیک، لازم است که یک محل کشت سلول جداگانه و استریل داشته باشد. بنابراین بیشتر آزمایشگاه‌ها از هودهای با جریان Laminar استفاده می‌کنند. در هودهای Laminar می‌بایستی یک لامپ UV و جریان هوای فیلتر شده تعبیه شده باشد. این هود باید در جایی قرار گیرد که حداقل رفت و آمد و شلوغی را داشته باشند.

• هود شیمیایی:

یک هود شیمیایی جهت تهیه و کاربا محلول‌ها

• فضای هاروست و لام‌گیری

بهتر است فضایی محفوظ جهت کنترل دما و رطوبت، در نظر گرفته شود.

• سایر تجهیزات:

دستگاه انکوباتور، فور، یخچال و فریزر، دستگاه سانتریفوژ، PH متر، دستگاه بخور گرم، میکروسکوپ نوری و اینورت، ، رطوبت‌سنج و دماسنج، بن ماری و سینک.

نمونه‌های رایج برای بررسی‌های سیتوژنتیکی:

خون محیطی (Peripheral Blood )

نمونه خون محیطی را به حجم کمی از محیط کشت حاوی سرم جنین گاوی(FBS) و فیتوهماگلوتینین (PHA) اضافه می‌کنند که لنفوسیت‌های T را تحریک به تقسیم می‌نماید. برای کشت کروموزومی خون محیطی، باید در حد امکان از خون تازه که به آن ماده ضد انعقاد سدیم هپارین اضافه شده است، استفاده شود. کشت کروموزومی معمولا ۷۲ ساعت زمان نیاز دارد.

سلول‌ها تحت شرایط استریل در دمای C˚٣٧ و به مدت ٣ روز کشت داده می‌شوند و سپس کلسمید به محیط کشت اضافه می‌شود. این ماده ویژگی بسیار سودمندی در جلوگیری از تشکیل دوک داشته، به‌طوری‎‌ که تقسیم سلولی را طی متافاز، زمانی که کروموزوم‌ها به حداکثر فشردگی خود رسیده‌اند و بنابراین قابل مشاهده‌اند، متوقف می‌کند. در ادامه نمک هیپوتونیک اضافه می‌شود که باعث لیز سلول‌ها می‌شود. سپس با مخلوط متانول و اسیداستیک (فیکس) شستشو انجام گرفته و لام‌گیری صورت می‌گیرد. در مرحله‌ی بعد که Aging نامیده می‌شود لام‌ها به مدت چند ساعت تا چند روز در دمای مشخصی قرار داده می‌شوند. این‌کار جهت بالا بردن وضوح بندها است. مرحله‌ی بعد Banding است. یک بند به این صورت تعریف می‌گردد: قسمتی از کروموزوم که از طریق تیره‌تر شدن یا روشن‌تر شدن توسط یک یا چند تکنیک بندینگ، به وضوح از قطعات مجاورش قابل افتراق می‌باشد. باندهایی که به وسیله‌ی یک روش خاصی رنگ تیره به خود می‌گیرند، ممکن است با دیگر روش‌های رنگ‌آمیزی رنگ روشن پیدا نمایند. در روش‌های بندینگ اولیه، به منظور تولید یک الگوی باندی فلورسنت، از کیناکرین موستارد یا دی‌هیدروکلرید کیناکرین استفاده می‌گردید. این روش بر پایه‌ی الگوی بندینگ Q می‌باشد. روش دیگر بندینگG-bands نام دارد، که درآن معمولا از مخلوط رنگ گیمسا به عنوان ماده‌ی رنگ‌آمیزی استفاده می‌شود.

در برخی از تکنیک‌های بندینگ، الگوهایی ایجاد می‌شود که شدت رنگ‌گیری آن‌ها، متضاد با الگوهای ایجاد شده با روش G-bands است، این روش‌ها، روش‌های معکوس R-bands نامیده می‌شوند.

تکنیک‌های بندینگ در دو گروه اصلی قرار دارند:

(1) دسته اول باندهایی را ایجاد می‌کنند که در طول یک کروموزوم کامل وسالم، انتشار یافته‌اند و شامل تکنیک‌هایی می‌باشند که الگوهای همانند‌سازی DNA را نشان می‌دهند که از جمله آن‌ها می‌توان R-bands ، Q-bandsوG-bands را نام برد.

(2) دسته دوم اجزا ساختمانی خاصی از کروموزوم‌ها را رنگ‌آمیزی می‌کنند و لذا منجر به ایجاد تعداد محدودی از باندها می‌شوند. این روش‌ها شامل روش‌هایی می‌باشند که هتروکروماتین اجباری (C-bands)، باندهای تلومریک (T-bands) و نواحی ساماندهی نوکلئولوس(NORs) را آشکار می‌سازند.

روش رنگ‌آمیزی با گیمسا معمول‌ترین ‌آنهاست. در این روش کروموزوم‌ها ابتدا با تریپسین تیمار می‌شوند تا محتوای پروتئینی آن‌ها دناتوره شود . هر باند در این روش تقریبا حاوی ۵ الی ١۰ میلیون باز است و ممکن است در برگیرنده‌ی صدها ژن باشد. رنگ گیمسا از ائوزین آنیونی و تیازین کاتیونی (1:2) تشکیل شده است. رسوب رنگ در کروموزوم‌ها در مناطقی تشکیل می‌شود که فسفات‌هایDNA در فاصله‌ی صحیح از هم قرار گرفته باشند، تا دو مولکول تیازین را به هم متصل کنند و سپس به مولکول ائوزین متصل می‌شوند. به‌ طور کلی باندهای مثبت گیمسا (نواحی تیره) که غنی از AT هستند، کمتر رونویسی شده، تراکم بیشتر و ژن‌های اندکی دارند. این مناطق آبگریز هستند. پروتئین‌های آب‌گریز نواحی متراکم را حفظ می‌کنند و رسوب ترکیب تیازین–ائوزین را تسهیل می‌کنند. باندهای منفی گیمسا (نواحی روشن) که غنی از GC هستند، بیشتر رونویسی می‌شوند، تراکم کمتر و ژن‌های بیشتری دارند. این مناطق آبگریزی کمتری داشته و در نتیجه کمتر برای رسوب تیازین-ائوزین مناسبند. درجه‌ی وضوح به وسیله‌ی تعداد باندهای مشاهده ‌شده در یک مجموعه‌ی هاپلویید معین می‌گردد.

مرحله‌ی بعدی مهمترین مرحله‌ و قسمت تشخیصی آزمایش کاریوتایپ است که شامل انتخاب گستره‌ی متافازی، شمارش تعداد کروموزوم‌ها و سپس آنالیز دقیق الگوی نواربندی کروموزوم‌ها است.

مغزاستخوان (Bone Marrow):

برای اکثر لوسمی‌ها، به جز برخی موارد که از خون محیطی استفاده می‌شود، از نمونه مغز استخوان استفاده می‌کنند. سلول‌های مغزاستخوان با رشد سریع، باید در معرض مواد غذائی بیشتری قرار بگیرند.

کشت مغز استخوان به دو صورت کشت معمولی و کشت قدرت تفکیک بالا صورت می‌پذیرد.کشت معمول خود به سه صورت زیر انجام می‌پذیرد.

کشت مستقیم (direct): به لوله‌ی حاوی محیط کشت کامل و نمونه کلسمید اضافه شده و بعد از 30-60 دقیقه هاروست می شود.

کشت کوتاه مدت (24-48-72 ساعته): بعد از مدت زمان مورد نظر به لوله‌ها کلسمید اضافه و بعد از 30 دقیقه هاروست می‌شود.

کشت کلسمید در طول شب(ONC): حدود 20 میکرولیتر کلسمید در ساعت 5 یا 6 عصر به لوله‌ی حاوی محیط کشت و نمونه اضافه می‌شود و صبح روز بعد هاروست می‌گردد.

برای به دست آوردن کروموزوم‌های بلندتر باید سیکل سلولی را در مرحله‌ی S بوسیله‌ی یک مهار کننده مانند تیمیدین متوقف کرد.بعد از حدود 15 ساعتمهار کننده از طریق شستشو خارج شده و سپس بعد از حدور 4 الی هفت ساعت کلسمسد اضافه می‌شود و بعد از گذشت حدود 20 دقیقه هاروست انجام می‌گردد.

انتخاب نوع کشت بر اساس علت مراجعه صورت می‌پذیرد.

مایع آمنیون (Amniotic Fluid)

مایع آمنیوتیک در هفته 17 -15 حاملگی، توسط پزشک متخصص زنان به میزان 15-20 سی‌سی گرفته و در دو لوله پلاستیکی استریل قابل سانتریفوژ تقسیم می‌شود. نمونه‌ها به سرعت و در دمای مناسب به آزمایشگاه منتقل می‌شود. مایع آمنیوتیک به رنگ زرد کمرنگ می‌باشد و اغلب در مراحل بعدی حاملگی وقتی غلظت سلول‌ها بالاتر است، رنگ مایع کدر می‌شود. ابتدا لوله‌های حاوی نمونه سانتریفوژ شده و محلول رویی برای آنالیز تست‌های شیمیایی فریزمی‌شود. رسوب باقی مانده را با تکان آرام دوباره به حالت محلول در اورده وسه سی‌سی محیط مناسب برای هر کشت اضافه می‌شود .بهتر از محیط کشت‌های مختلف برای هر کشت استفاده کرد. دو فلاسک کشت داده می‌شود. کشت‌ها به مدت 7-6 روز انکوبه می‌شوند. سپس رشد سلول‌ها با استفاده از یک میکروسکوپ invert بررسی می‌گردد. در صورت مشاهده‌ی کلونی محیط برداشته شده و با محیط تازه تعویض می‌گردد.هر دو روز یکبار نمونه‌ها با میکروسکوپ بررسی وو محیط آن تعویض می‌شود.بعد از رشد کلونی به اندازه‌ی کافی، می توان یکی از لوله‌ها را هاروست و لوله‌ی دیگر را subculture کرد.به این صورت که محیط در لوله‌ی جداگانه‌ای ریخته می‌شود سپس به نمونه یک سی‌سی ازمحلول حاوی EDTAو تریپسین اضافه می‌شود.در این مرحله برای جدا شدن سلول‌ها ضربه زده شود.سپس دو بار باPBS شستشو انجام شده و مجددا محلول trypsin-EDTA اضافه شده و بعد از ضربه محیط کشت اضافه می‌گردد. با جدا شدن سلول‌ها از سطح ظرف کشت،برای خنثی کردن اثر تریپسین یک سی‌سی محیط کامل حاوی سرم اضافه می‌شود در این مرحله با توجه به مقدار نمونه، درون ظرف‌های دیگر آن را aliquot کرده و 3 سی‌سی محیط تازه اضافه می‌شود و انکوبه می‌گردد.

جهت هاروست به ازای هر سی‌سی نمونه حدود 75میکرولیتر کلسمید اضافه می‌گردد وپس از حدود سه ساعت انکوبه کردن مرحله‌ی تریپسینه کردن انجام می شود و سوسپانسیون به دست امده15 دقیقه با دور 1000rpm سانتریفوژ و سپس هاروست می‌شود.

فانکونی: فانکونی نوعی کم‌خونی است که با علائم بالینی متنوعی همراه می‌باشد. نحوه‌ی توراث این بیماری اتوزومال مغلوب است. سلول‌های بیماران FA نسبت به عوامل پیوند متقابلDNP، مانند مایتومایسینC (MMC) و دی اپوکسی بوتان (DEB) یا سیس پلاتین، حساس هستند و در مواجهه با دارو به ‌صورت مهار بیش از حد، توقف چرخه‌ی سلولی و شکستگی کروموزومی، آشکار می‌شوند.

در این آزمایش، لنفوسیت‌های Tموجود در نمونه‌ در حضور مایتومایسین کشت داده می‌شوند. بهتر است برای هر بیمار، از یک کنترل منفی، ترجیحاً هم‌سن و جنس مشابه استفاده شود. چهار کشت برای بیمار و کنترل منفی انجام می‌شود. یک کشت HR بدون مایتومایسین و سه کشت با غلظت‌های متفاوت از مایتومایسین گذاشته می‌شود. سپس نمونه‌ها هاروست و رنگ‌آمیزی می‌شوند. پس از آن شکست‌ها و ناهنجاری‌ها در زیر میکروسکوپ بررسی می‌گردد. اگر تعداد شکست‌های کروموزومی نسبت به نمونه‌ی کنترل ۱/۰ بیشتر باشد تشخیص کم‌خونی فانکونی مثبت است.

سندروم ایکس شکننده(Fragile X Syndrome)

سندرم ایکس شکننده یا مارتین بل، که بیشتر به عنوان یک بیماری تک‌ژنی شناخته می‌شود، یک بیماری ارثی است که از والدین به فرزندان منتقل می‌شود. این بیماری یکی از شایع‌ترین علل عقب‌ماندگی‌های ذهنی می‌باشد. این بیماری در پسران بیشتر مشاهده‌ شده و علائم شدیدتری دارد.

این بیماری به این دلیل سندرم ایکس شکننده نامیده می‌شود، که در گستره‌ی کروموزومی این بیماران در انتهای بازوی بلند کروموزوم ایکس یک مکان شکننده دیده می‌شود. تقریبا در تمام موارد این بیماری جهش در بالادست ژن FMR1 و به دنبال آن بسط تکرارهای سه نوکلئوتیدی CGG در درون این ژن و متیلاسیون غیرطبیعی آن رخ می‌دهد. دفعات این تکرار در افراد ممکن است متفاوت باشد. در افراد طبیعی تعداد این تکرارها ده تا پنجاه بار است در حالیکه در افراد مبتلا تعداد این تکرارها ممکن است به بیش ‌از دویست بار برسد. افزایش غیرطبیعی این تکرارها منجر به خاموشی ژن FMR1 شده و در نتیجه پروتئین FMRP تولید نمی‌گردد. شدت اختلال با تعداد این تکرارها نسبت مستقیم دارد.

یک سوم از بیماران مبتلا به سندرم ایکس شکننده ویژگی‌های بیماری اتیسم را نیز نشان می‌دهند.

برای بررسی سندروم X شکننده سه نوع کشت صورت می‌گیرد: برای انجام این آزمایش سه کشت انجام می‌شود. کشت اول بصورتHR (72 ساعته)، کشت دوم با محیط کشت Low folate همراه با سرم گاوی، و کشت سوم به همراه تایمیدین اضافه (92 ساعته). ادامه مراحل آزمایش همانند بالا انجام و در نهایت لام‌های آماده شده در زیر میکروسکوپ بررسی و مطالعه می‌شوند.